Рослинні дефензини - це багаті на цистеїн пептиди із 45 - 54 амінокислотних залишків, які характеризуються консервативною структурою <$E beta alpha beta beta>, стабілізованою 4 - 5 дисульфідними зв'язками. Ці пептиди є одними із ключових молекул природної імунності рослин. Вони пригнічують ріст широкого кола фітопатогенних грибів, а деякі з них характеризуються антибактеріальною активністю. На додаток, дефензини виконують й інші біологічні функції, не пов'язані зі захистом рослин. Саме мультифункціональні властивості дефензинів роблять їх перспективними кандидатами для створення нових препаратів із антимікробними властивостями. Для дизайну таких сполук важливо з'ясувати зв'язки між структурою і біологічною активністю молекул. Раніше отримали ендогенний та рекомбінантний дефензин 1 сосни звичайної (PsDef1), який проявив високу активність проти фітопатогенних грибів і бактерій. Це є перший дефензин хвойних рослин, структура якого була досліджена методом ЯМР, зокрема, авторами цієї роботи. Представлено гетерологічну експресію й очищення рекомбінантного дефензину 2 Pinus sylvestris L. (PsDef2), амінокислотна послідовність якого ідентична до такої PsDef1 на 90 %. Використання системи експресії pET32/BL21-CodonPlus (DE3)-RIL дало можливість отримати дефензин 2, кон'югований із тіоредоксином (TRX), у розчинній формі. Встановлено, що найвищий вихід розчинного TRX-PsDef2 досягається за індукції трансформованих клітин 0,5 мМ ізопропіл-<$E beta>-D-1- тіогалактопіранозидом (ІПТГ) і культивуванням їх протягом 3 год за температури 25 <$E symbol Р>C. TRX-PsDef2 очищено на HisPurNi-NTA колонці. Гібридний протеїн розщеплено ентерокіназою. PsDef2 виділено зі суміші продуктів протеолізу й ентерокінази за допомогою іонообмінної хроматографії SP-Sepharose Fast Flow та ступінчастого градієнта концентрації NaCl (0,05 - 1 М). Чистота отриманого рекомбінантного PsDef2 була вищою за 95 %, що перевірено за допомогою електрофорезу у 16,5 % ДСН-ПААГ. Встановлено, що рекомбінантний пептид PsDef2 має активність щодо фітопатогенного гриба Fusarium sporotrichiella й ооміцета Phythophtora gonapodyides за концентрації 5 мкМ. Отримання рекомбінантного PsDef2 відкриває можливість не тільки вивчити його біологічну активність, але й дослідити його структуру спектроскопічними методами (круговим дихроїзмом і ЯМР), що надасть змогу встановити зв'язки між структурою та функцією дефензинів сосни.

  Повний текст PDF - 2.008 Mb    Зміст випуску     Цитування публікації

  Якщо, ви не знайшли інформацію про автора(ів) публікації, маєте бажання виправити або відобразити більш докладну інформацію про науковців України запрошуємо заповнити "Анкету науковця"