Функціональні властивості білків визначаються їх конформаційною структурою, яка стабілізується двома класами сильних і трьома класами слабких зв'язків. Дифтерійний токсин (ДТ) - це білкова молекула, що складається з двох взаємно незалежних глобулярних доменів A та B, з'єднаних разом дисульфідними містками. Детоксикація ДТ є процес руйнування його нативної тривимірної структури під впливом формальдегіду і високої температури. Відомі прецеденти реверсії токсичності анатоксину. Відповідно до діючих правил національних органів, не існує ніяких конкретних вимог для перевірки цієї можливості. Таким чином, існує необхідність залучення спеціальних методів тестування. У вивченні структури, динаміки і функції нуклеїнових кислот і білків широко використовується флуориметрія. Вважається, що зміна інтенсивності світіння і розташування максимумів флуоресценції може вказувати на дію якогось фактора як причини порушення просторової конфігурації білка і зміни біологічних властивостей білка, як слідства. Мета дослідження - визначення спектрів флуоресценції різних серій нативного очищеного дифтерійного анатоксину (НОДА). Було проведено флуориметрію чотирьох зразків НОДА, виготовлених на підприємстві ПАТ "Фармстандарт-Біолік", з використанням флуориметра Hitachi 850. Максимуми флуоресценції в усіх досліджених зразках знаходилися у діапазоні поміж 330 і 345 нм, характерному для флуоресценції білків. Не виявлено очевидного впливу вміста білка у препараті на інтенсивність його флуоресценції. Максимальний пік флуоресценції виявлено у найдавнішому зразку № 1 від 2007 р. (395 умовних одиниць), мінімальний рівень - у зразку № 4, виробленому у 2015 р. (266 умовних одиниць. З даних літератури відомо, що інтенсивність флуоресценції неочищених зразків дифтерійного анатоксину (ДА) в процесі та відразу після детоксифікації була на порядок нижчою за одержані показники інтенсивності світіння НОДА: від 12 до 26 умовних одиниць, тоді як нативний ДТ характеризувався ще нижчим рівнем світіння: від 2 до 9 умовних одиниць. Очевидно, що у процесі трансформації ДТ в анатоксин та подальшого його зберігання у білкових молекулах відбуваються денатураційні процеси, які проявляються у розпушенні білкових глобул, вивільненні залишків триптофана, що підвищує інтенсивність флуоресцентного світіння. Ступінь денатурації безумовно пов'язана з рівнем специфічної (імуногенної) активності зразку ДА. Отже якщо активність зберігається, то ймовірно йдеться про першу стадію денатурації і функціональний перехід в межах нативної структури білка. За повного розгортання амінокислотного білкового ланцюжку активність ДА вочевидь втрачається, на що може вказувати відносне підвищення рівню світіння зразків НОДА. У випадку непояснимого гасіння флуоресценції зразка можна припустити можливість реверсії його токсичності. Наведені дані свідчать про те, що флуориметрія може бути використана для моніторинга конформаційних змін зразків ДА і стати знаряддям для регуляції контролю якості вакцини шляхом впровадження у виробництво демонстрації динаміки спектрів флуоресценції. Скринінг спектрів флуоресценції напрацьованих виробничих зразків анатоксину в процесі їх зберігання може допомогти виявленню серій, якість котрих викликає сумніви.

  Повний текст PDF - 483.159 Kb    Зміст випуску     Цитування публікації

  Якщо, ви не знайшли інформацію про автора(ів) публікації, маєте бажання виправити або відобразити більш докладну інформацію про науковців України запрошуємо заповнити "Анкету науковця"