Побудована енциклопедія за алфавітним принципом. Її зміст можна поділити на такі групи: оглядові — про Острозьку академію та середовище, в якому вона діяла (мистецтво та архітектуру, храми різних конфесій, католицькі та іудейські навчальні заклади тощо); Острозьку друкарню та її видавничу справу (починаючи від Азбуки 1578 року і до Часослова 1612 року); персональні — про викладачів та випускників академії, діячів культури ХVІ — ХVІІ ст. (Г. і М.Смотрицькі, Д.Наливайко, К.Лукаріс, А.Римша та ін.), пов'язаних з нею, вчених ХІХ — ХХ ст., які досліджували історію Острога (М.Максимович, Я. Перлштейн, К. Харлампович, С. Кардишевський, І. Франко, М. Грушевський, А. Сендульський, М. Тучемський, Й. Новицький, І. Огієнко тощо), сучасних діячів та інституції, які сприяли збереженню історичної пам'яті та відродженню Острозької академії. Серед них визначна роль належить видатному історику-джерелознавцю Миколі Ковальському, зусиллями якого було започатковано традицію ґрунтовних видань з історії Острозької академії. Важливе місце у цьому оригінальному виданні відводиться розповідям про засновників академії — князів Острозьких (особливо Василю-Костянтину та його племінниці Галшці). Ключовим є також питання підготовки до видання у 1581 році Острозької Біблії, робиться припущення, що частину роботи здійснювали не лише викладачі, а й студенти академії. Подано детальну історіографію даної проблеми, у якій спростовується міф про Новгородську «Геннадієву Біблію» 1499 року, на основі якої нібито з'явилася Острозька.