D-Тир-тРНК<^>Тир-деацилаза (DTD) є консервативним білком, що забезпечує додатковий коригувальний етап гідролізу помилково аміноацильованих субстратів D-Тир-тРНК<^>Тир. DTD здатна приcкорювати гідроліз ефірного зв'язку в комплексі D-Тир-тРНК<^>Тир, утворюючи вільну тРНК та D-Тир, таким чином запобігаючи включенню D-амінокислот до білків. Деацилаза розрізняє D- та L-аміноацильні залишки в аміноацильованій тРНК та не гідролізує останні. Структурні основи такої специфічності та механізм гідролізу D-аміноацил-тРНК за участі DTD є недостатньо зрозумілими. Мета. Клонувати D-Тир-тРНК<^>Тир-деацилазу з T. thermophilus(DTDTT), оптимізувати умови її експресії в E. coli, розробити ефективний метод очищення з високим виходом високоякісного ферменту, для структурних та функціональних досліджень. Ампліфікацію та клонування гена DTD з геномної ДНК T. thermophilus в pProEXHTb експресуючий вектор проведено за стандартними молекулярно-біологічними методами. Очистку рекомбінантного DTD білка проведено хроматографічно. Залишки гістидину відщеплено від DTD протеазою вірусу тютюну (TEV), ефективність реакції перевірено Вестерн-блот аналізом з анти-His-антитілами. Молекулярну масу очищеної DTDTT визначено гель-фільтрацією. Одержану конструкцію pProEXHTb, що містить DTD послідовність з T. thermophilus, експресовано в E.coli штаму BL21(DE3)pLysS. Цільовий рекомбінантний білок виділено і очищено комбінацією хроматографій: афінної (Ni-NTA), аніон-обмінної (Q-Sepharose) та гель-фільтрації (Superdex S200) до чистоти 90 %. Вихід рекомбінантної DTD склав 2 мг з одного літру культури. Визначена молекулярна маса очищеної DTD з T. thermophilus 32 кДа свідчить на користь її димерної структури. Висновки: одержаний вектор pProEXHTb, що містить DTD з T. thermophilus, і підібрані умови очистки надають змогу одержати рекомбінантний DTD в кількостях, достатніх для подальших структурно-функціональних досліджень.

  Повний текст PDF - 320.244 Kb    Зміст випуску     Цитування публікації

  Якщо, ви не знайшли інформацію про автора(ів) публікації, маєте бажання виправити або відобразити більш докладну інформацію про науковців України запрошуємо заповнити "Анкету науковця"