На правах рукопису. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2019. Дисертаційна робота присвячена ідентифікації нових молекулярних компонентів механізмів глюкозної катаболітної регуляції та селективної пексофагії на моделі метилотрофних дріжджів. Встановлено, що сигналізування глюкози у механізмі транскрипційної індукції у H. polymоrpha опосередковується нетранспортуючим сенсором Hxs1, а механізм катаболітної репресії залежить від ефективності транспорту глюкози та потенційого трансцептора Gcr1. Аналоги транскрипційних факторів головного шляху репресії у S. сerevisiae, Mig1, Mig2 та Tup1, не є компонентами механізму глюкозної репресії у H. pоlymorpha, але є необхідними для фізіологічної регуляції типу пексофагії. Розроблено ефективний метод клонування ATG генів пексофагії. Встановлено, що функція продукту гену ATG26 –ергостеролглюкозилтрансферази, є селективно необхідною для пексофагії, але не загальної автофагії, і є консервативною у метилотрофів. Також показано, що продукт гену ATG28 є одним із спец ифічних компонентів автофагійного апарату, відповідальних за селективне розпізнавання пероксисом. Новий білок пероксисомних мембран, Pex36, є необхідним для процесів як біогенезу, так і деградації пероксисом у P. pastoris та H. polymorpha. Також встановлено консервативну роль компонента вакуолярного сортингу білків Vps15 у автофагійних процесах. Розроблена нова платформа для мультикопійної інтеграції векторів у геном H. роlуmorpha на основі маркерів селекції ADE1 та FLD1. Базуючись на мутантних штамах з пошкодженою глюкозною репресією, були сконструйовані ефективні продуценти ряду білків медичного та біотехнологічного значення.^UThe main topic of this dissertation work concerns elucidating molecular components involved in regulation of peroxisome biogenesis and autophagic degradation, signaling mechanisms that maintain their homeostasis, sensing of hexose compounds and related catabolite regulation. Yeasts are convenient eukaryotic models for such cell biology research. It is of a significant fundamental and practical interest as some aspects of the obtained knowledge can be translated to human health and various biotechnological processes. 43 Methylotrophic yeasts have a number of advantages for studies on catabolite regulation. Like most other so-called "non-conventional yeasts", they are obligatory aerobes whose signaling mechanisms are not adapted to fermentative growth. Synthesis of peroxisomal and cytosolic enzymes of methanol utilization as well as peroxisome prollifgeration are induced by methanol but is strictly repressed by sugars and ethanol, - effector molecules that rely on distinct catabolic pathways. Catabolite inactivation of peroxisomal enzymes by glucose or ethanol involves degradation of organelles in vacuoles via pexophagy. Signaling and structural mechanisms providing selectivity for autophagy, pexophagy in particular, still remaine not fully elucidated. We demonstrated that glucose signaling in the mechanism of transcriptional induction of glucose transporters in H. polymropha is mediated by a non-transporting sensor Hxs1 (Hexose sensor), whereas the signaling for transcriptional repression in H. pylymorpha is rather "non-conventional" and depends on glucose transport and on the unique to this species protein Gcr1 (Glucose catabolite repression), - a potential transceptor (transporting receptor), which also possesses a regulatory function in the absence of glucose. It has also been established that putative homologs of transcriptional factors of the main repression pathway in S. cerevisiae: Mig1, Mig2 and Tup1, are not the essential components of glucose repression mechanism in H. pоlymorpha. It was also observed that Gcr1 and Hxs1 do not directly participate in the signaling for pexophagy. However, the MIG1, MIG2 and TUP1 gene products are necessary for the physiological regulation of the autophagy type in response to exogenous stimuli. Based on the H. polymorpha mutants with aberrant glucose regulation and developed new approaches for multicopy vector integration, producers of a number of recombinant proteins of medical and biotechnological significance have been constructed. The proposed modified expression platform relies only on sugar substartes for regulation of recombinant protein production. Another goal was to identify new genetic elements controlling pexophagy, paying main atention on those not involved in general autophagy. A collection of P. pastoris pexophagy-deficient mutants has been isolated and a positive selection method for the cloning of the affected genes by functional complemetation elaborated. By functional analysis of mutants in several newly identified pexophagy genes in P. pastoris and H. polymorpha it has been established that function of the product of the ATG26 gene – ergosterolglucosyl transferase, is selectively required only for pexophagy, but not for the general autophagy, and is conserved in these two methylotrophs. It was also found that the product of the P. pastoris ATG28 gene is one of the components of the autophagic apparatus responsible for selective recognition of peroxisomes. A novel peroxisome membrane protein Pex36 has been identified as necessary for both peroxisome biogenesis and degradation in P. pastoris and H. polymorpha. Our data highlight the importance of comparative studies on signaling mechanisms in different yeast species from the point of view of both, fundamental science and biotechnological applications.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія. – ДЗ «Дніпропетровська медична академія Міністерства охорони здоров'я України», 2021.Встановлено, що при внутрішньовенному введенні інфузійного розчину НАЕS-LX-5 % впродовж перших 7 діб після термічної травми шкіри в усі терміни спостереження у дослідних тварин дистрофічні та некробіотичні процеси в епідермісі та дермі були менш виражені, ніж у тварин з контрольної групи порівняння, що отримувала 0,9 % розчин NaCl. Позитивна динаміка морфологічних змін структурних компонентів шкіри, зменшення проявів альтерації, неоангіогенез, активна крайова проліферація епідермоцитів при застосуванні коригуючого чинника, пов'язані з властивістю НАЕS-LX-5 % утримувати плазму крові в судинах, що значно зменшує набряки, а також ендотелій-протекторною дією даного препарату.На ультраструктурному рівні дослідження встановлено, що позитивний ефект застосування коригуючого чинника більш виразний через 7 та 14 діб експерименту. Субмікроскопічний стан шкіри в пізні терміни після опіку (через 21 та 30 діб досліду) при застосуванні розчину HAES-LX-5 % свідчить про значну нормалізацію її структурних компонентів.^UWithin the framework of scientific cooperation between National Pirogov Memorial Medical University and SI "Institute of Blood Pathology and Transfusion Medicine of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine" (Lviv) the effect of 0.9 % NaCl solution (control drug) and HAES-LX-5 % infusion solution at a dose of 10 ml/kg into the inferior vena cava for 7 days on the skin structure of intact rats, as well as on early (1, 3 and 7 days) and late (14, 21 and 30 days) periods after burn damage of the skin of the II-III degree with an area of 21-23 % of the body surface was investigated.Mature male rats, whose average weight was 160-180 g, were divided into 5 groups: group I – animals that underwent only femoral vein catheterization (intact rats, n=9); group II – catheterized animals without burns, with intravenous infusion of 0.9 % NaCl solution (n=54); group III – catheterized animals without burns, with intravenous infusion of HAES-LX-5 % (n=54); group IV – catheterized animals after skin burns, with intravenous infusion of 0.9 % NaCl solution (control) (n=54); group V – catheterized animals after skin burns, with intravenous infusion of HAES-LX-5 % (study drug) (n=54). All manipulations on rats were carried out according to the recommendations of the European Commission for biomedical research in the use of animals and the recommendations of the State Pharmacological Center of the Ministry of Health of Ukraine and the "Rules of preclinical safety assessment of pharmacological agents (GLP)" and rules of humane treatment of experimental animals (approved by the Bioethics Committee of National Pirogov Memorial Medical University).Histological examination of the skin of male rats, which during the first 7 days was administered 0.9 % NaCl solution or the drug HAES-LX-5 % found that in all periods of observation microscopic organization of skin components in both early and late stages of the study when entering these infusion solutions are similar to those in intact rats.At the ultrastructural level of study of rat skin components with the introduction of 0.9 % NaCl solution or HAES-LX-5 %, these solutions during all observation periods also do not change the submicroscopic organization of the epidermis, intercellular substance, cells and blood capillaries of the fibrous connective tissue of the papillary and papillary tissue.It was found that at the light-level of the study in the early stages of the experiment (1, 3 and 7 days) after thermal injury under conditions of 0.9 % NaCl solution compensatory-adaptive changes in the structural components of the skin are combined with signs of destructive disorders. In the epidermis of the affected area of skin there is the destruction of epithelial cells (all its layers). Vascular disorders in the dermis are combined with changes in fibroblasts, homogenization and edema of the components of the intercellular substance.In the late stages of the experiment (after 14, 21 and 30 days) there is a deepening of destructive changes in the structural components of the skin in the affected area. This process becomes irreversible. As a result, the formation of granulations and their maturation are slow. Marginal epithelialization of the wound with the formation of a full, differentiated into layers of regenerate is also slowed down. After 30 days of the experiment under the conditions of application of 0.9 % NaCl solution in the healing area there are no formed papillae of the dermis and skin appendages.At the ultrastructural level of the study of the skin of male rats after thermal trauma under the conditions of previous application of the first 7 days of 0.9 % NaCl solution it was found that in the early stages of the experiment – stages of shock and early toxemia (1, 3 and 7 days) compensatory-adaptive changes combined with signs of destructive disorders. In the epitheliocytes of the epidermis of the affected area of skin there is the destruction of the nuclei and cytoplasm. Vascular disorders in the dermis are combined with changes in fibroblasts, the intercellular substance of fibrous connective tissue.In the late stages of the experiment – the stages of late toxemia and septicotoxemia (14, 21 and 30 days) there is a further development and deepening of destructive-dystrophic changes of all ultrastructural components of the affected skin, which often become irreversible. The processes of granulation tissue formation, its transformation into connective tissue, as well as marginal epithelialization are slow.

Об'єкти - обструктивна та необструктивна форми азооспермії у чоловіків: клінічна симптоматика, діагностика, гістологія біоптатів яєчок, гормональні, біохімічні та цитогенетичні показники; мета - з'ясування патогенетичних особливостей непліддя чоловіків з азооспермією шляхом вивчення інструментальних, гістологічних, біохімічних і генетичних показників; методи - клініко-анамнестичні, загальноклінічні, інструментальні (УЗД, соноеластографія), гістологічні (дослідження біоптатів яєчок), біохімічні (активності ензимів аргіназо-NO-синтазнї, глутатіонової антиоксидантної та Са2+-залежної АТФ-гідролазної систем, цитогенетичні та статистичного аналізу; результати - з'ясувані патогенетичні особливості інфертильних чоловіків із сереторно-ендокринною та екскреторно-обтураційною формами азооспермії шляхом аналізу порушень гемодинаміки яєчок, гістологічого дослідження сім'яних канальців, гормональних, біохімічних і цитогенетичних показників фертильного потенціалу. Вперше показано зниження регуляторного індексу відновленого глутатіону в сім'яній плазмі чоловіків із необструктивною формою азооспермії, що свідчить про зниження сумарної потужності антиоксидантної системи. Доведено зниження співвідношення відновленого глутатіону до окисненого, зниження співвідношення аргінази до індуцибельної ізоформи NO-синтази, зростання співвідношення метаболітів оксиду азоту - нітратів до нітритів, зростання активності індуцибельної ізоформи NO-синтази. Розширені уявлення про патогенез різних форм азооспeрмії та отримані нові дані щодо механізмів порушень фертильного потенціалу чоловіків з азооспермією. На основі гістологічного аналізу тканини яєчка пацієнтів з необструктивною формою азооспермії показано, що у всіх зразках наявні зміни у звивистих сім'яних канальцях, їх діаметр зменшений (гіпоплазія) щодо норми, стінки сім'яних канальців потовщені, базальна мембрана виражено фіброзована, сперматогeнез або повністю відсутній, або зупинявся на стадії сперматогоній. Між об'ємом яєчка, концентраціями в сироватці крові інгібіна В та ФСГ, активностями аргінази та індуцибельної NO-синтази встановлені високі кореляційні зв'язки, що свідчить про патогенетичне значення цих показників; впроваджено - у науковий і навчальний процес закладів охорони здоров'я та Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького; галузь - медицина.^UThe objects - obstructive and non-obstructive forms of azoospermia in men; clinical symptoms, diagnosis, histology of testicular biopsies, hormonal, biochemical and cytogenetic parameters; the purpose - elucidation of pathogenetic features of infertility in men with azoospermia by studying instrumental, histological, biochemical and genetic parameters; methods - сlinical and anamnestic, general clinical, instrumental (ultrasound, sonoelastography), histological (examination of testicular biopsies), biochemical ( activity of arginase-NO-synthase enzymes, glutathione antioxidant and Ca2+-dependent ATP-hydrolase systems, cytogenetic and statistical analysis; results - the pathogenetic features of infertile men with seсretory-endocrine and excretory-obstructive forms of azoospermia were clarified by analyzing disorders of hemodynamics of the testes, histological examination of the seminal tubules, hormonal, biochemical and cytogenetic indicators of fertility potential. For the first time, a decrease in the regulatory index of restored glutathione in the seminal plasma of men with non-obstructive azoospermia has been shown, which indicates a decrease in the total power of the antioxidant system. Extended ideas about the pathogenesis of various forms of azoospermia and new data relevant to the mechanisms of fertility disorders of men with azoospermia were obtained. Based on histological analysis of testicular tissue of patients with non-obstructive azoospermia, it is shown that in all samples there are changes in the tortuous seminal tubules and their diameter is reduced (hypoplasia) relative to normal, the walls of the seminal tubules are thickened, the basement membrane is markedly fibrous, and spermatogenesis is either completely absent or stopped at the stage of spermatogonia. High correlations have been established between testicular volume and serum concentrations of inhibin B and FSH and arginase and inducible NO-synthase activities, which indicates the pathogenetic significance of these indicators; introduced - in the scientific and educational process of health care institutions and Danylo Halytskyi Lviv National Medical University; branch - medicine.

Біловецька С.Г. Дослідження ролі вітаміну А на структурно функціональну організацію печінки при інтоксикації організму сірчанокислою міддю. Кваліфікаційна наукова праця на правах рукопису. Дисертація на здобуття ступеня доктора філософії за спеціальністю 091 – «Біологія» (Природничі науки). – Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, Харків, 2023. Дисертацію присвячено дослідженню впливу вітаміну А на функціональну активність печінки на початкових стадіях Сu-індукованого фіброзу. З цією метою досліджували такі показники: вимірювали біохімічні печінкові ферменти АЛТ, АСТ, ГГТ, ЛФ, внаслідок чого визначали наявність такої патології як фіброз печінки. Наряду з цим досліджували електропровідність біологічних рідин (сироватки крові) та тканин печінки (цільної та гомогенізованої), визначення зазначених параметрів об’єктів дослідження використовували біофізичні, біохімічні, цитологічні та гістологічні методи досліджень. Для встановлення взаємозв’язку електропровідності з функціональною активністю печінки та можливості використання електропровідності в якості діагностичного методу функціональної активності печінки. Печінка виконує метаболічну, регуляторну та детоксикаційну функції. В умовах захворювань, надмірного токсичного навантаження та стресових факторів, печінка піддається різноманітним структурно-функціональним змінам. Фіброз печінки багато років вважали необоротнім процесом, останнім часом з’явилися роботи, які показують можливість оборотності цього процесу, але ефективність та ступінь цього процесу дуже різна та фактори впливу на цей процес досі мало досліджені. Саме тому дослідження механізмів оборотності, яка пов’язана з особливостями фіброгенезу печінки та ідентифікація факторів, включених в його процес та деградацію, є вкрай важливими питаннями. Формування фіброзу може розглядатися як одна із форм адаптації організму, яка проявляється на рівні печінки. Отже, необхідні всебічні дослідження механізмів формування адаптивних реакцій печінки, в тому числі і фіброзу на дії різноманітних токсичних чинників середовища, і розробка способів їх усунення. Як відомо, понад 80% вітаміну А накопичується в печінці, особливо в зірчастих клітинах. Деякі дослідники вважають, що вітамін А може сприяти відновленню функції печінки при фіброзі. Під час розвитку фіброзу та цирозу печінкові зірчасті клітини активуються та змінюють свій фенотип на міофібробластоподібний, втрачаючи вітамін А, після чого активовані зірчасті клітини починають розмножуватися та скорочуватися, що сприяє відкладанню позаклітинного матриксу та розвитку фіброзу. Разом із цим показано, що при фіброзі знижується рівень вітаміну А в зірчастих клітинах. Залишається нез’ясованим як саме змінюється функціональна активність печінці при піддержанні рівню вітаміну А на рівні контролю, зокрема введенням екзогенного вітаміну А. Вплив вітаміну А на розвиток організму варіюється залежно від віку, концентрацій, наявності патологій і має велике значення для регуляції фізіологічного процесу в організмі. Ця залежність обумовлена необхідністю відповідності між функціями вітаміну А та розвитком організму, особливо в періоди зародження і раннього дитинства. Саме тому дослідження впливу вітаміну А на структурно-функціональну організацію печінки з фіброзом є актуальним дослідженням. Метою роботи було дослідження можливої ролі вітаміну А у запобіганні розвитку фіброзу печінки на ранніх етапах формуваннях Сu-індукованого фіброзу печінки. У даному дослідженні вивчалася можливість відновлення функцій печінки через зміщення балансу в її функціонуванні. Для досягнення цієї мети на ранніх стадіях розвитку Cu-індукованого фіброзу печінки тваринам був введений вітамін А в 300 МО/100 г. Ці самі тварини продовжували перебувати під впливом індуктора фіброгенезу, після чого була вивчена динаміка їх маси тіла, що є комплексним показником функціонального стану організму, функціональні показники печінки, дослідження зв’язку електропровідності печінки зі структурною організацію тканини на фоні розвитку фіброзу та впливу ряду гепатотропних сполук. Крім того, проводились морфологічні дослідження печінки, здатність печінки до регенерації оцінювалася за кількістю двоядерних гепатоцитів. При підтримці концентрації вітаміну А в організмі на початковій стадії розвитку Cu-індукованого фіброзу печінки можливо забезпечити оборотність цього процесу. Ключові слова: Сu-індукований фіброз печінки, гістологія печінки, електропровідність біологічних систем, темпоральні характеристики фіброзу, вітамін А, мікс-фактор, хлорогенова кислота, активність АЛТ, АСТ, ГГТ, ЛФ.^UBilovetska S.G. Study of the role of vitamin A in the structural and functional organisation of the liver under the copper sulfate intoxication. Qualification scientific paper, manuscript. Thesis for the scientific degree of Doctor of Philosophy in the speciality 091 «Biology» (Natural Sciences). V. N. Karazin Kharkiv National University of the Ministry of Education and Science of Ukraine, Kharkiv, 2023. Dissertation is devoted to the study of the effect of vitamin A on the functional activity of the liver in the initial stages of Cu-induced fibrosis. To this purpose, the following indicators were studied: biochemical liver enzymes ALT,AST,GGT,ALP were measured, which resulted in the determination of the presence of such pathology as liver fibrosis. In addition, the electrical conductivity of biological fluids (blood serum) and liver tissue (whole and homogenized) was studied; biophysical, biochemical, cytological and histological methods were used to determine these parameters of the study objects. To establish the relationship between electrical conductivity and liver functional activity and the possibility of using electrical conductivity as a diagnostic method for liver functional activity. The liver performs metabolic, regulatory and detoxification functions. Under conditions of disease, excessive toxic load and stress factors, the liver undergoes various structural and functional changes. For many years, liver fibrosis was considered an irreversible process, and recently there have been studies showing the possibility of reversibility of this process, but the effectiveness and degree of this process is very different and the factors influencing this process are still poorly understood. That is why the study of the mechanisms of reversibility associated with the peculiarities of liver fibrogenesis and the identification of factors involved in its process and degradation are extremely important issues. The formation of fibrosis can be considered as one of the forms of adaptation of the body, which manifests itself at the level of the liver. Therefore, comprehensive studies of the mechanisms of liver adaptive reactions, including fibrosis, to various environmental toxic factors and the development of ways to eliminate them are needed. It is known that more than 80% of vitamin A accumulates in the liver, especially in stellate cells. Some researchers believe that vitamin A can help restore liver function in fibrosis. During the development of fibrosis and cirrhosis, hepatic stellate cells are activated and change their phenotype to myofibroblast-like, losing vitamin A, after which activated stellate cells begin to proliferate and shrink, which contributes to the deposition of extracellular matrix and the development of fibrosis. At the same time, it has been shown that fibrosis decreases the level of vitamin A in stellate cells. It remains unclear how exactly the functional activity of the liver changes when the level of vitamin A is maintained at the control level, in particular by the administration of exogenous vitamin A. The effect of vitamin A on the development of the body varies depending on age, concentrations, and the presence of pathologies and is of great importance for the regulation of physiological processes in the body. This dependence is due to the need to match the functions of vitamin A with the development of the body, especially in the periods of embryo and early childhood. That is why the study of the effect of vitamin A on the structural and functional organization of the liver with fibrosis is a relevant research. The aim of the study was to investigate the possible role of vitamin A in preventing the development of liver fibrosis in the early stages of Cu-induced liver fibrosis.This study investigated the possibility of restoring liver function by shifting the balance in its functioning. To achieve this goal, at the early stages of Cu-induced liver fibrosis, animals were administered vitamin A at 300IU/100g. The same animals continued to be exposed to the inducer of fibrogenesis, after which the dynamics of their body weight, which is a complex indicator of the functional state of the body, liver function, the study of the relationship between liver electrical conductivity and structural organization of the tissue against the background of fibrosis and the effect of a number of hepatotropic compounds were studied. In addition, morphological studies of the liver were performed, and the ability of the liver to regenerate was assessed by the number of binuclear hepatocytes.If the concentration of vitamin A in the body is maintained at the initial stage of development of Cu-induced liver fibrosis, it is possible to ensure the reversibility of this process.Keywords: Cu-induced liver fibrosis, liver histology, electrical conductivity of biological systems, temporal characteristics of fibrosis, vitamin A, mix factor, chlorogenic acid, ALT,AST,GGT,ALP activity.